【摘要】 以青霉素生產菌種87117#為出發菌種，采用紫外線誘變復合前體動態后處理的方法，結合限氧條件下的搖瓶篩選，從177支前體抗性株中篩出XY-137#高產突變株。該菌株搖瓶效價平均提高了8.8%,且遺傳特性穩定，單位菌絲產物合成能力強。XY-137#菌株在百噸罐中經過近百批的生產驗證，其放罐效價、發酵指數、罐批產量平均提高了3.83%、5.66%和2.69%。
【關鍵詞】 紫外誘變； 動態后處理； 理性篩選； 青霉素高產菌株
ABSTRACT Using Penicillium chrysogenum #87117 as starting strain, a penicillin high yield strain #XY-137 was obtained by UV irradiation combined with precursor-resistant strain in shake flask selection method under limited oxygen. Penicillin potency of strain #XY-137 was increased by 8.8% cultured in shaking flasks. Average productivity of about 100 batches fermentation level was increased by 2.69%～5.66% than that of strain #87117 in 100-ton fermentor.
KEY WORDS UV mutagenesis; Dynamic post-treatment; Rational screening; Penicillin high-producing strain
由于青霉素原料的后加工與半合成領域愈來愈廣泛，世界青霉素市場競爭十分激烈。生產廠家唯有不斷地提高生產水平，降低生產成本以增強企業的競爭力，而優質高產菌種的選育和應用是其中的基礎和關鍵。
隨著青霉素菌種生產能力的提高，傳統育種方法的局限性越來越明顯。理性化篩選是應用遺傳學和生物化學的原理，根據已知或可能的目的產物生物合成途徑的調控機制和產物的分子結構，設計篩選方法，定向選出有效的性狀突變株。我們依據理性育種的理念，參照現有生產條件設立基本篩選模型，采用紫外輻射震動工業生產菌種穩定的遺傳結構，再輔以限氧條件下耐前體突變株的篩選，達到選育高產菌株的目的。
1 材料與方法
1.1 出發菌種
青霉素生產菌種Penicillium chrysogenum 87117#。1.2 培養基
(1)分離及斜面培養基 蔗糖、甘油、酵母粉、NaCl、CaSO4、微量元素、瓊脂。
(2)種子培養基 以蔗糖、玉米漿為碳、氮源。
(3)發酵培養基 以乳糖、玉米漿為主要碳、氮源，加無機鹽類組成。
1.3 菌種誘變與篩選
(1)紫外誘變 將出發菌株的單孢子懸液置紫外燈下40cm處照射90s。
(2)前體動態后處理 定量吸取經過紫外線照射后的孢子液，分別加入含有不同劑量的前體(苯乙酸胺)的種子培養基試管中，使每支試管的前體終濃度在0～4.8%之間。將上述試管置25℃恒溫振蕩培養18h左右，然后稀釋分離在固體培養基平板上。
(3)前體抗性菌落檢出 平板置25℃恒溫培養8d。從耐受不同濃度前體處理后長出的抗性菌落中挑選孢子相對豐富、組織比較致密的菌落進行斜面傳代培養，以備搖瓶篩選。
(4)搖瓶定向篩選低氧耗、低菌絲量的高產菌株 將搖瓶機轉速由通常的220r/min降至160r/min，在低通氣條件下進行搖瓶篩選。后續的高產株特性考察和工藝優化均在此條件下進行。
搖瓶篩選考察指標為發酵效價和菌絲生長量(packed mycelial volume,pmv)。
1.4 樣品檢測
發酵液倒入刻度離心管中，3000r/min離心10min。取上清液，用美國OI公司Flow SolutionⅣ化學自動分析儀檢測其中的青霉素效價(u/ml)。沉淀部分所占體積與發酵液體積的比值即為pmv(%)。
2 結果
2.1 XY-137#高產突變株的選育
出發菌株87117#先經過兩次自然選育，然后采用紫外線復合前體動態后處理，挑取177支抗性株，在限氧條件下進行搖瓶篩選。于3.84%前體耐受濃度下獲得XY-137#高產突變株，以87117#為對照，其5d和7d搖瓶相對效價分別為107.4%和110.3%，搖瓶效價平均提高了8.8%。
2.2 XY-137#菌株特性考察
(1)菌種純度 XY-137#菌株自然分離后正常型菌落達96.3%，符合上生產罐的要求。
(2)斜面周期 XY-137#與出發菌株相比其斜面外觀有所改變，孢子長勢較弱，顏色明顯變淺。若仍按原周期培養斜面，則種子瓶的培養時間需延長4～6h。經過試驗比較，將斜面培養周期推后1d，種子瓶生長正常，且搖瓶前期發酵效價略有提高。
(3)單位菌絲產物合成能力 由圖1可知，與出發菌種相比XY-137#菌株的搖瓶效價有顯著提高，而菌絲量較低，說明XY-137#菌株單位菌絲產量明顯優于87117#對照菌種。
1：87117#相對效價； 2：XY-137#相對效價；
3：87117#菌絲生長量； 4：XY-137#菌絲生長量
圖1 XY-137#與87117#菌種搖瓶相對效價和菌絲量比較 (4)穩定性試驗 XY-137#菌株經斜面傳代后進行搖瓶考察，F1～F4代相對效價依次為100%、98.9%、101.1%和99.7%，證明其穩定性良好。
2.3 XY-137#菌株搖瓶工藝優化
(1)培養基改良 進行了多輪均勻設計試驗。種子瓶經回歸分析得到的最優配方中，減少了質量不易控制的玉米漿加量，增加適量的無機氮源，碳源比例也稍做了增加，優化后種子瓶的菌濃明顯增大，發酵效價提高了7.5%。
發酵培養基則基于大罐的用料和配比，嘗試添加適量固形有機氮源來穩定搖瓶效價。經搖瓶發酵試驗，在多種有機氮源中最終選擇加入少量的麩質粉，搖瓶效價提高了6%左右。
(2)增加前體補入量 考慮到XY-137#系耐前體突變株，故欲增加前體補入量，以滿足高產菌株的需要。結果顯示將前體濃度調高3%，補入體積不變，XY-137#菌株搖瓶效價提高了9.4%(表1)。表1 前體增量試驗結果
2.4 XY-137#菌株生產試驗
XY-137#菌株在100m3罐中考察其生產能力及對原材料和工藝條件的適應性。經統計，該菌株放罐95批，在發酵周期短4h、主要原材料消耗沒有增加的情況下，XY-137#菌株的放罐效價、發酵指數、罐批產量比同期87117#菌株分別提高了3.83%、5.66%和2.69%。
上罐試驗同時還證實XY-137#菌株不僅具備高產能力，而且發酵液粘度比87117#有所降低，可以減少動力消耗。
3 討論
對于青霉素這樣產量已達較高水平的老品種，其產生菌久經人工選育，不論在遺傳背景或生理特性方面都發生了復雜的變化。因此在做進一步誘變育種時，不但要考慮誘變劑的選擇，更重要的是對篩選方法作合理的設計，使變異株產量的提高和主要性狀的改變能明顯地表達出來。有報道根據青霉素的生物合成途徑在固體培養基上加入纈氨酸、6-氨基青霉烷酸、苯乙酸等底物進行抗性篩選［1，2］；或采用原生質體融合技術，使兩株營養缺陷型菌株融合，篩選融合子［3］均取得了一定的效果。
前體對青霉素產生菌有毒性，能抑制其孢子發芽和菌絲的分支［4］。篩選以前體為標記的耐前體高產突變株，不僅可以解除毒性，而且使前體直接摻入抗生素的生物合成而提高產量［5］。由于動態后處理有富集正變株的作用［6］，故可以增加高產株的篩出幾率。
確定篩選條件決定著菌種選育的方向。特別是生產菌種，定向篩選的目標皆應來自大生產的需要。在發酵工業中，降低氧耗、降低動力消耗對生產成本的降低有著重要意義。本試驗在低通氣條件下篩選菌絲量較少的高產菌株，使選育到的菌株更具實際應用價值。
生產實踐證明，XY-137#高產菌株特性達到理性篩選設計要求。