目的：探討吸水鏈霉菌FC904（S.hygroscopicus FC904）原生質(zhì)體形成的影響因素。方法：用溶菌酶處理S.hygroscopicus FC904的菌絲體，比較在不同條件下原生質(zhì)體的形成數(shù)。結(jié)果：S.hygroscopicus FC904在不同條件下原生質(zhì)體的形成數(shù)不同,其原生質(zhì)體形成的最適條件為：在菌絲體生長培養(yǎng)基中添加0.7%甘氨酸及10%的蔗糖；采用生長旺盛期的菌絲體制備原生質(zhì)體；溶菌酶適宜濃度為2mg/ml；溶菌溫度范圍30～37℃；溶菌前每毫升壓積菌絲體宜用P緩沖液5ml懸浮。結(jié)論：菌絲體生長培養(yǎng)基成分、菌齡、溶菌酶濃度、溶菌溫度是影響S.hygroscopicus FC904原生質(zhì)體形成的主要因素。
關(guān)鍵詞：吸水鏈霉菌FC904 原生質(zhì)體 制備
新型強(qiáng)效免疫抑制劑雷帕霉素以其強(qiáng)效低毒而備受世人注目。吸水鏈霉菌FC904（S.hygroscopicus FC904）是福建省微生物研究所分離的能產(chǎn)生雷帕霉素的菌株。本文摸索該產(chǎn)生菌原生質(zhì)體形成的最適條件，為進(jìn)一步進(jìn)行誘變育種、原生質(zhì)體融合以及遺傳學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 菌株 S.hygroscopicus FC904
1.2 菌絲體培養(yǎng)基 由葡萄糖，酵母膏，蛋白胨，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O組成。
1.3 主要試劑 甘氨酸(上海新華化工廠),溶菌酶（上海伯奧生物科技公司）,原生質(zhì)體緩沖液（P緩沖液）按文獻(xiàn)［1］配制。
1.4 原生質(zhì)體制備
在菌絲體生長培養(yǎng)基中添加10%蔗糖及0.7%甘氨酸，移種入孢子斜面培養(yǎng)物，于26℃振蕩培養(yǎng)（200r/min）42～46h；離心收集菌絲體，加入P緩沖液洗滌菌絲體兩遍,每遍離心（3000r/min）10min，棄上清液；每毫升壓積菌絲體加入P緩沖液5ml懸浮；加入溶菌酶（P緩沖液配制，25nm纖維微孔濾膜過濾,終濃度2mg/ml）,30～37℃作用60min，其間每隔15min用無菌吸管吹打以利原生質(zhì)體釋放,并取樣用顯微鏡觀察原生質(zhì)體形成情況。酶解結(jié)束用差速離心除去未酶解菌絲體，過濾收集原生質(zhì)體，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，比較在不同因素下原生質(zhì)體的形成數(shù)。
2 結(jié) 果
在添加有甘氨酸及蔗糖的培養(yǎng)基中生長的菌絲體有利于制備原生質(zhì)體，其濃度以甘氨酸0.7%及蔗糖10%最為適宜。不同菌齡的菌絲體對溶菌酶的敏感度不同，處于生長旺盛期（菌齡42～46h）的菌絲體最有利于該菌株原生質(zhì)體的形成。適合于該菌株原生質(zhì)體形成的溶菌酶濃度為2mg/ml,繼續(xù)提高溶菌酶濃度，原生質(zhì)體形成數(shù)不再提高。有利于S.hygroscopicus FC904原生質(zhì)體形成的適宜溫度范圍為30～37℃。溶菌前的菌絲體密度也會(huì)影響溶菌效果，離心后每毫升壓積菌絲體宜加P緩沖液5ml懸浮（表1,2）。
表1 不同因素對S.hygroscopicus FC904原生質(zhì)體形成的影響
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影響因素
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平均原生質(zhì)體數(shù)(個(gè)/ml)
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甘氨酸+蔗糖濃度(%)
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0.1+1
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0
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0.5+5
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4.6×107
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0.7+5
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9.5×107
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0.7+10
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4.5×108
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0.7+20
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2.2×108
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菌齡（h）
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24～30
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0
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42～46
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3.8×108
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50～54
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3.0×105
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溶菌酶濃度(mg/ml)
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0.5
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0
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1.0
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6.5×105
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2.0
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4.1×108
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4.0
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4.6×108
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溶菌溫度(℃)
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26
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4.5×105
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30
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3.6×108
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37
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表2 菌絲體密度對S.hygroscopicus FC904原生質(zhì)體形成的影響
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菌絲體壓積∶P緩沖液體積
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平均原生質(zhì)體數(shù)(個(gè)/ml)
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1∶2
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7.7×105
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1∶5
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4.3×108
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1∶8
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3 討 論
原生質(zhì)體無細(xì)胞壁，有利于生化或遺傳操作。原生質(zhì)體的分離依賴于菌絲細(xì)胞壁在裂解酶中的降解，同時(shí)受菌絲體培養(yǎng)基的成分、菌齡、溶菌酶濃度及酶解溫度等因素的影響。由于不同微生物的遺傳及生理特征各不相同，因此，原生質(zhì)體的分離制備因種而異，必須摸索適合于各自菌株的最佳原生質(zhì)體形成條件。
(1)在添加適當(dāng)濃度的甘氨酸及蔗糖的培養(yǎng)基中生長的菌絲體有利于制備原生質(zhì)體。細(xì)胞壁肽聚糖中的四肽側(cè)鏈由L-丙氨酸、D-谷氨酸、L-賴氨酸和D-丙氨酸組成［2］，甘氨酸可以替代肽聚糖中的D-丙氨酸，從而影響細(xì)胞壁之間的相互交聯(lián)，而蔗糖則可能會(huì)擾亂菌體生長時(shí)的代謝過程［3］。因此，甘氨酸和蔗糖在抑制菌絲體生長的同時(shí)也能提高細(xì)胞壁對溶菌酶的敏感性，在二者之間必須尋找一個(gè)適宜的濃度。對S.hygroscopicus FC904來說，菌絲體生長培養(yǎng)基中添加0.7%甘氨酸與10%蔗糖，最有利于S.hygroscopicus FC904原生質(zhì)體的形成。
（2）有報(bào)道太長菌齡的菌絲壁易老化增厚，不利于原生質(zhì)體的釋放，太短菌體易破裂，原生質(zhì)體釋放量減少［4］。本文結(jié)果也表明菌齡適中，處于對數(shù)生長期的菌絲體最有利于該菌株原生質(zhì)體的形成。
（3）實(shí)驗(yàn)表明，溶菌酶濃度＞2mg/ml、溶菌溫度30～37℃都有利于制備原生質(zhì)體，但是最佳溶菌酶濃度及溶菌溫度應(yīng)盡可能選擇較低者，因?yàn)槿芫笣舛燃叭芫鷾囟仍礁撸|(zhì)體越不穩(wěn)定且易破裂，造成再生困難［3］。
（4）溶菌前菌絲體密度太大也不利于溶菌，因?yàn)橥染康木z體在相同的溶菌酶濃度下，菌絲體密度越大，所用的溶菌酶量就越少。